Chętnych do przeprowadzenia zajęć z tym zestawem w swojej szkole, organizacji, itp. prosimy o kontakt pod adresem: instytutidei@gmail.com , poinformujemy o możliwych terminach i warunkach. Aktualnie możliwe poprowadzenie zajęć w lutym 2024.

Cena zestawu, wraz z przeprowadzeniem zajęć dla 6 osób (3 pary) przez instruktora - 599zł, dla miejscowości: Iława, Ostróda, Lubawa, Kisielice, Susz, Nowe Miasto Lubawskie, Zalewo i bezpośrednie okolice. W przypadku zajęć w innych miastach obowiązuje dodatkowa dopłata - zależna od odległości od Iławy. Szkoły i instytucje mogą zamawiać zestaw bez instruktora. Należy wtedy przechowywać elementy zestawu w lodówce/zamrażarce i zużyć w okresie 30 dni od nabycia. 

Zajęcia trwają 3 godziny. Pół godziny krótkiego wstępu teoretycznego, reszta praktyka laboratoryjna. 

Do kupującego należy zagwarantowanie pomieszczenia z dostępem do bieżącej, ciepłej wody i prądu. Uczestników kursu należy poinstruować o potrzebie spokojnej i bezpiecznej pracy. Należy spytać uczestników czy nie są uczuleni na ampicylinę. Kupujący musi także, po 2-3 dniach, gdy widoczne są już wyniki eksperymentu, zabić bakterie środkiem bakteriobójczym, np. wybielaczem do tkanin i wyrzucić do zwykłych śmieci mieszanych lub zutylizować w inny, bezpieczny sposób.

ZESTAW BIOSURFERS #1 DO PRAKTYCZNEJ NAUKI BIOLOGII SYNTETYCZNEJ. AKTYWACJA FUNKCJI BAKTERII POPRZEZ DODANIE MATERIAŁU GENETYCZNEGO

1 KRÓTKI OPIS EKSPERYMENTU

Witam na początku Twojej przygody z biologią syntetyczną. Ten zestaw ma ci udowodnić że możesz zajmować się tworzeniem nowych organizmów nawet w swoim domu. Uwierzysz też że sama/sam możesz realizować swoje eksperymenty. Wystarczy żebyś zrozumiał o co tu chodzi, a o resztę dopytasz sztuczną inteligencję online czy osobę która coś o tym wie. Gdzie skończysz swoją przygodę? Może na projektowaniu terapii genowych dla ludzi czy na zarządzaniu fabryką w której pracują miliony małych stworzeń?

Co to jest biologia syntetyczna? To projektowanie i produkcja organizmów z nowymi funkcjami. W przyszłości może to będą nasi wysłańcy do zagospodarowywania nowych planet, teraz to głównie bakterie, które np. pomagają w produkcji leków.

Bakteria, my zresztą też, działa w oparciu o swój kod DNA. Jeśli chcemy żeby zrobiła coś nowego musisz w nią „wpisać” nowy kod. Lub zmienić/naprawić już w niej istniejący. To właśnie zrobisz w tym eksperymencie. Bakteria dostanie od Ciebie fragment kodu, który potrzebny jest do produkcji części maszynki cząsteczkowej, pomagającej w rozłożeniu substancji przypominającej cukier, dodanej do pożywki (którą też przygotujesz). Jedna z części tego niby cukru zabarwi się na niebiesko, pod wpływem tlenu. Po tym kolorze poznasz czy eksperyment się udał.

Warto wiedzieć że w bakterii, obok jej głównego kodu – DNA chromosomalnego występują naturalnie, mniejsze, oddzielne kawałki kodu. Tradycyjnie przedstawiamy je jako okręgi, a nazywamy plazmidami. W tym eksperymencie dostarczysz nowe plazmidy do bakterii.

W jednej próbówce masz bakterie E.coli zwane komórkami kompetentnymi. W drugiej właśnie te kawałki DNA, zwany plazmidami. Łączysz jedno z drugim, zostawiasz na dzień, dwa i sprawdzasz czy się udało. Z tym że nie możesz po prostu wymieszać jednego z drugim i zostawić byle gdzie. Trzeba rozłożyć to na kilka kroków.

Bakteria musi zjeść i mieć ciepło żeby dobrze żyć i pracować.

Więc na początku przygotowujemy dla niej dom, czyli płytkę na której jest jedzenie, tzw. podłoże agarowe z pożywką SOC. Musimy to zrobić tak aby nie było w domku konkurencji, więc zabijamy wszystko co żyje wysoką temperaturą. Nasz domek jest tylko dla naszych bakterii. I nie powinien stykać się z innymi mikroorganizmami. Dzięki temu wyraźniej zobaczymy wyniki naszego eksperymentu.

Bakterie traktujemy raz delikatnie raz szokowo.

Bakterie przechowujemy w niskiej temperaturze, nawet do -80 st. C. Jeśli chcemy jej użyć, wyciągamy ją z zamrażarki na lód. Żeby powoli dostosowywały się do środowiska. To właśnie nazywa się tu rozmrażaniem na lodzie. Jednak po tym, przez chwilę poddajemy je szokowi cieplnemu aby lepiej przyjmowała obcy materiał genetyczny. Tzw. komórki kompetentne to specjalne szczepy, które łatwiej wchłaniają obce DNA niż „dzikie” organizmy, ale i tak trzeba temu procesowi pomóc. Dzięki krótkotrwałej zmianie temperatury błona bakterii staje się bardziej przepuszczalna dla substancji z zewnątrz.

Wstrząsanie, ciepło i wirowanie.

Podczas wstrząsania wszystko lepiej się miesza, a w cieple bakterie lepiej się rozmnażają, tworząc widoczne kolonie. Przez wirowanie oddzielamy niepotrzebny nam płyn od bakterii i pożywki. Dzięki temu bakterie mają więcej jedzenia wokół siebie.

Antybiotyk, zwalniacz hamulca i niby cukier który stanie się niebieski,

Do pożywki dodasz IPTG, X-gal i ampicylinę. Dzięki temu będziemy kontrolować eksperyment i widzieć co się dzieje. 

Kod (plazmid), który dodajesz do bakterii ma też inną funkcję. Dzięki niej bakteria zaczyna rozkładać ampicylinę, która normalnie bakterie zabija. Jeśli Twoje bakterie żyją to wiesz, że przyjęły kod, który im podałeś. Ale żeby je zobaczyć, trzeba zrobić jeszcze dwie rzeczy. Podać jej substancję która odblokowuje hamulec, który zwykle przylepia się do DNA, blokując rozkładanie jednego z cukrów. Robi to IPTG. Dzięki temu kod w bakterii zaczyna być wykonywany. Bakteria zaczyna produkować maszynki – enzymy, które rozkładają nasz niby cukier X-gal, którego część zaczyna być utleniana i przez to staje się niebieska.

Dzięki temu możemy obserwować wyniki naszych eksperymentów.

I to, w skrócie, na tyle. Już wiesz co będziesz robił, a jeśli Cię to zainteresuje, zapraszam do studiowania szczegółów i dalszych eksperymentów z biologią syntetyczną. Na razie przeprowadź poniższy eksperyment, żeby wejść praktycznie do świata biotechnologii. Jeśli przeprowadzisz go samodzielnie, rozumiejąc każdy krok, ta wiedza zostanie już z tobą przez długie lata. Najlepiej zapamiętujemy to co sami robimy, aktywnie.

DOBRE PRAKTYKI:

Jeśli nie masz do dyspozycji laboratorium poproś kogoś kto Ci pomoże w utrzymywaniu odpowiedniej temperatury na poszczególnych etapach procedury – będzie łatwiej. Przed przystąpieniem do pracy zorganizuj się i przemyśl wszystkie kroki, żeby nie tracić czasu w trakcie. Zadbaj aby środowisko pracy było jak najbardziej sterylne. Np. odkaź stół alkoholem 70%.

Przetestowaliśmy nasz zestaw w warunkach domowych. Działa.

Osoba odpowiedzialna za projekt BIOSURFERS: Krzysztof Kurpiecki ( kontakt: instytutidei@gmail.com ).  

2 INSTRUKCJA PRZEPROWADZENIA EKSPERYMENTU

Dla własnego bezpieczeństwa PRACUJ W RĘKAWICZKACH I OKULARACH OCHRONNYCH. Zestaw musi być obsługiwany pod nadzorem osoby powyżej 18 lat.

2.1 SKŁAD ZESTAWU I SPIS DODATKOWYCH RZECZY

Zestaw na 3 eksperymenty, na 6 osób (3 pary)

Co jest w zestawie:

• Bakterie kompetentne E.coli -niepatogenne (3 kriopróbówki  x 50 μl - naklejka biała), 

• Plazmid z kodem genetycznym (3 kriopróbówki x 2 μl - naklejka czerwona)

• LB Agar (40g) – próbówka plastikowa

• DMSO (5ml) - butelka szklana

• X-gal (20mg) w próbówce Eppendorf- naklejka niebieska

• Ampicylina w próbówce Eppendorf (80mg - naklejka żółta)

• IPTG w próbówce Eppendorf (100mg – naklejka czarna) 

• głaszczki 3szt.

• szalki Petriego (płytki) 6 szt.

• strzykawka 1ml – 3 szt.

• pipety jednorazowe – 20 szt.

• rękawiczki ochronne, maseczki ochronne

Na dole strony znajdziesz zdjęcie poszczególnych elementów zestawu.

Dodatkowo potrzebujesz:

• Zamrażarki, lodówki, zrobionego lodu i naczynia (np. półlitrowa miska)

• Mieszadła magnetycznego z grzaniem lub pracy z termometrem i utrzymywaniem temperatury.

• Wirówki – możesz zrobić ją z sznurka i tektury, tzw. bączek. Ale obejdziesz się i bez niej.

• Alkoholu etylowego – roztwór 70% - do dezynfekcji powierzchni roboczych.

• Rękawic termicznych lub innego zabezpieczenia dla rąk. Okularów ochronnych.

• Autoklawu lub kuchenki mikrofalowej z naczyniem odpowiednim do użycia w mikrofali (może być szklana butelka lub słoik z niebarwionego szkła równej grubości). Albo innego sposobu doprowadzenia płynu do wrzenia.

• Wagę o czułości miligramowej lub dobre oko i precyzję.

• Jałowej wody – może być to przegotowana woda z kranu.

2.2 PRZYGOTOWANIE AGARU Z DODATKAMI

Przygotowanie 200ml podłoża LB Agar:

UWAGA: WCZEŚNIEJ PRZYGOTUJ ROZTWORY Z PUNKTU 2.3 TAK ABY ZDĄŻYĆ JE DODAĆ NIM AGAR ZGĘSTNIEJE!

Do odpowiedniego naczynia odważ 8 g podłoża, uzupełnić jałową wodą (około 200ml) i wymieszać. Uzyskaną zawiesinę autoklawować przez 10-20 min w temp. 121°C. Po schłodzeniu do temp. 50-60 °C ponownie wymieszać przed użyciem.

Jeśli nie masz wody jałowej możesz użyć zwykłej, przegotowanej wody. Tylko pamiętnej aby stykała się, przed użyciem jedynie z jałowymi naczyniami.

Jeśli nie masz autoklawu użyj kuchenki mikrofalowej. 

UWAGA – GORĄCE!  UWAGA – DAJ UJŚĆ POWIETRZU!

Przełóż mieszankę do odpowiedniego naczynia lub butelki do mikrofali (upewnij się, że jest ono odporna na wysoką temperaturę). Przykryj naczynie odpowiednią pokrywką, papierem do pieczenia czy białym ręcznikiem papierowym, ale pozostaw niewielki otwór, aby umożliwić ucieczkę pary. Jeśli masz nakrętkę, nie dokręcaj jej do końca (zagrożenie pęknięciem). Podgrzewaj mieszankę w mikrofali z kilku krótkich interwałach, mieszając delikatnie po każdym interwale, aby zapewnić równomierne rozgrzanie. Doprowadź 3 razy do zagotowanie mieszanki. Nie dopuść żeby wylała się z butelki. Użyj rękawic termicznych lub podobnych zabezpieczeń dla rąk.

Ochłodzenie: Po rozpuszczeniu wszystkich składników i zagotowaniu podłoża, wyjmij je z mikrofali i ostudź do temperatury 50-60°C. Nie mniej bo zgęstnieje.

Przygotuj czystą, sterylną przestrzeń roboczą i używaj sterylnych narzędzi. W warunkach domowych możesz wszystko odkażać alkoholem 70% choć nie jest to tak skuteczne jak autoklaw czy ogień.

2.3 DODAWANIE AMPICILYNY, IPTG, X-GAL DO AGARU O TEMPERATURZE 50st. C.

Do ostudzonego do 50 st C. agaru dodaj ampicylinę, IPTG, X-gal. Możesz też poeksperymentować i do części agaru nie dodać antybiotyku czy IPTG/X-gal – będziesz mieś wtedy porównanie.  IPTG/X-gal możesz też dodać na powierzchnię ostudzonego agaru czy nawet po wzroście kolonii bakterii. Wodę/DMSO możesz odmierzać pipetą lub strzykawką.

AMPICYLNA

UWAGA – ampicylina drażni oczy, skórę i płuca (pracuj w okularach ochronnych). Stężenie ampicyliny w podłożach agarowych zwykle wynosi między 50 a 100 μg/ml w zależności od zastosowania i szczepu bakterii. Najczęściej stosowanym stężeniem ampicyliny dla bakterii E. coli jest 100 μg/ml. Aby osiągnąć stężenie 100 μg/ml w 200 ml agaru, potrzebujesz 20 mg ampicyliny. Rozpuść 20 mg ampicyliny w 1 ml (lub mniej) DMSO (pracuj w rękawiczkach – DMSO przenika przez skórę). 20 mg to tyle ile jest na zdjęciu. Dla porównania – moneta 1gr. Dodaj do agaru.

IPTG

Zalecamy rozpuszczenie liofilizatu IPTG w jałowej wodzie. Standardowe stężenie IPTG w podłożu to 0,1-1 mM. Potrzebujesz  około 25 mg liofilizatu IPTG rozpuszczonego w 1 ml wody, aby uzyskać 100 mM roztwór IPTG. Ta ilość wystarczy na 200ml podłoża agarowego. Jeśli nie masz wagi to 25mg to odmierz „na oko” , porównując do zdjęć poniżej.

X-GAL

Zalecamy rozpuszczenie liofilizatu X-gal w DMSO.

Typowe stężenie X-gal w podłożach agarowych wynosi 20-40 μg/ml. Dla stężenia  20 μg/ml potrzebujesz więc 4 mg X-gal.  

Aby rozpuścić 4 mg X-gal będziesz  potrzebować 0,2 ml DMSO. Następnie dodaj ten roztwór do 200 ml schłodzonego podłoża agarowego (o temp. ok. 50-55°C) i wymieszaj delikatnie przed wylaniem na płytki. 

Przykryj płytki pokrywką i w temperaturze pokojowej poczekaj godzinę aż zgęstnieją. 

2.4 WPROWADZENIE OBCEGO DNA (PLAZMID) DO BAKTERII

1. Rozmrozić komórki kompetentne na lodzie (ok. 10 min ). Włóż do naczynia lód i włóż tam probówkę z komórkami. 

2. Dodać 1-2 μl plazmidowego DNA , najlepiej wtedy gdy tylko zniknie ostatni kawałek lodu w probówce. Jeśli nie masz takiej pipety możesz spróbować sterylną, plastikową wykałaczką.  5 μl to około 1/4 małej (4mm) płaskiej kropli płynu.

3. Delikatnie wymieszać. Np. przez pipetowanie – po prostu wciągasz i wypuszczasz płyn z pipety. 

Uwaga! Nie używać worteksu (mechaniczna wstrząsarka).

4. Inkubować na lodzie przez 30-60 min . Czyli po prostu połóż w naczyniu z lodem z zamrażarki.

5. Inkubować przez 30–60 sekund w temp. 42 °C. Jest to tzw. szok cieplny. Próbówka musi być całkowicie zanurzona w wodzie o tej temperaturze przez dany czas.

6. Inkubować na lodzie przez 5 min .

7. Dodać 900 μl pożywki SOC (bez antybiotyku). Pożywka powinna być uprzednio ogrzana do temp. pokojowej.

8. Inkubować z wytrząsaniem przez 45-60 min w temp. 37 °C.

9. Wirować 2 min przy 2000-3000 RPM (obroty na minutę). Jeśli nie masz wirówki, patrz punkt 13.

10. Usunąć 800 μl supernatantu (to co jest płynem), a resztę wymieszać przez pipetowanie.

11. Przenieść 100 μl zawiesiny/pelletu (to co zostało na dnie próbówki) na przygotowaną szalkę Petriego (płytkę) i rozprowadzić jałową głaszczką po całej powierzchni podłoża. Płytki odwróć dołem do góry (w celu zapobieżenia spadania kondensatu z góry płytki na kolonie bakterii)

12. Płytki inkubować – zależnie od temperatury:

16 godz. w temp. 37 °C lub

24-35 godz. w temp. 30 °C lub

48 godz. w temp. 25 °C

Inkubacja to pozostawienie bakterii aby się rozrastały. Jeśli zapewnisz im temperaturę zbliżoną do ciepłoty człowieka będą rozmnażały się szybko. Jeśli nie , poczekasz troche dłużej.

13. Jeśli nie masz wirówki rozprowadź kilka kropel płynu po płytce i poczekaj kilka/kilkanaście minut aby przysechł. I tak samo odwróć płytki i inkubuj (punkty 11 i 12).

2.5 WYNIKI

Jeśli na szalce Petriego pojawiły się niebieskie kolonie bakterii oznacza to że udało Ci się zmodyfikować bakterię przez wprowadzenie do niej obcego DNA. Gratulacje!

Jeśli nie, przyczyny takiego stanu rzeczy mogą być różnorakie. Nie zniechęcaj się, powtórz eksperyment, poczytaj o najczęstszych błędach w laboratorium. Pomyśl co mogło pójść źle. Jeśli na   płytce z agarem są inne bakterie niż niebieskie, mogło dojść do zanieczyszczenia lub procedura nie była, w którymś kroku, dokładnie przestrzegana. Jeśli są tylko białe, może nie dodałeś Xgal/IPTG albo masz pecha i do bakterii dostał się dodatkowy kod, z nieznanego źródła.

Bakterie na płytkach możesz zabić polewając np. wybielaczem (uwaga na ręce i oczy) do tkanin i następnie wyrzucić płytki do śmieci mieszanych.

2.6 ZASTOSOWANA PRAKTYCZNE

To doświadczenie to jedna z podstawowych procedur w laboratoriach biotechnologicznych. Nazywa się to screening kolonii białe/niebieskie (  blue-white screening ). W biologi syntetycznej zmieniasz organizmy w różny sposób i chcesz wiedzieć czy nowe DNA dostało się tam gdzie trzeba. W tej metodzie, gdy dodajesz nowy kod DNA do plazmidu Puc19, niszczy on w nim tą część, która odpowiada za te niebieskie efekty. W związku z tym, jeśli bakterie na płytce są białe, prawdopodobnie oznacza to że kod, który dodałeś do plazmidu dostał się do bakterii.

Do tej procedury wykorzystano naturalny mechanizm bakterii. Włącza ona przerabianie cukru - laktozy tylko wtedy gdy lepsze źródła (np. glukoza) nie są dostępne. Pozwala to jej oszczędzać energię, która byłaby marnowana gdyby gen przerabiający laktozę był cały czas aktywny. (operon laktozowy)

Przykładowe prompty do ChatGPT, który powie ci o tym eksperymencie: 

„Opisz procedurę white-blue screening. Opisz rolę komórek kompetentnych, Puc19, X-gal, IPTG, ampicyliny. Wyjaśnij jak dla kogoś kto będzie przeprowadzał te doświadczenie pierwszy raz. Opisz możliwe rezultaty jakie mogą pojawić się na szalce Petriego. „

„Wyjaśnij znaczenie i mechanizm działania operonu laktozowego „

Chcesz więcej i prościej? Pytaj sztuczną inteligencję o szczegóły i proś o prostsze wyjaśnienia. 

Możesz poszukać też schematów w wyszukiwarkach obrazów np. wpisując: lacZ e.coli , IPTG X-gal,  IPTG X-gal, lac operon. Z nich można się wiele dowiedzieć.

Powyżej przykładowe wyniki eksperymentu. Zestawu używamy podczas naszego KURSU BIOLOGII SYNTETYCZNEJ. Obecnie istnieje możliwość przeprowadzenia zajęć z tym zestawem dla uczniów szkół czy innych organizacji. Kontakt: instytutidei@gmail.com 

Sprzedaż zestawu i prowadzenie zajęć będzie realizowane przez firmę zewnętrzną.

Poniżej niektóre elementy zestawu i ich nazwy (model może ulegać zmianie):

1. Szalka Petriego (płytka)

2. Kriopróbówka 

3. Próbówka Eppendorf

4. Strzykawka 1ml

5. pipeta plastikowa (mała/duża)

6. głaszczka

i nasza żarówka antystresowa, dostępna do wyczerpania zapasów

Za pomoc w naszych projektach edukacyjnych, serdecznie dziękujemy firmie A&A BIOTECHNOLOGY , produkującej świetne produkty dla laboratoriów i badaczy.

Informacja: Ta strona może interesować każdego kto szuka następujących produktów:

• zestaw do edukacji - inżynieria genetyczna

• pomoce dydaktyczne - bioinżynieria, edycja DNA,  Crispr/Cas

• zestawy edukacyjne - mikrobiologia, biologia syntetyczna

• nauka podstaw biohackingu

• zestawy praktyczne - wstęp do biotechnologii

• modyfikacja organizmów przez zmianę DNA